在檸檬酸的工業生產中都采用微生物發酵法，而有價值的只有幾種曲霉菌和酵母菌，其中黑曲霉菌是工業中具有競爭力的菌種，酵母中競爭力強的有解脂假絲酵母和季也蒙赤酵母等。 [7] 

黑曲霉是在瓊脂上培養的，在瓊脂上成局限菌落，在室溫下培養10~14天，成為豐富密集的孢子梗，菌落為黑色，有時也為深褐黑色。考慮到檸檬酸生產菌應具有產酸能力強和耐檸檬酸濃度高的特點，可采用酸性濾紙法、變色圈法和單孢子移植法將黑曲霉分離出來，以避免其他雜菌干擾，使其成為生產檸檬酸用黑曲霉。 [7] 

酵母的培養可用于檸檬酸生產的酵母有解脂假絲酵母和季也蒙假絲酵母2種。前者有很強的分解脂肪的能力，較好的炭源是正烷烴。后者可由烷烴發酵生成檸檬酸，也可由糖類發酵生成檸檬酸，酵母發酵pH值為3.5~4.0。 [7] 

1940年，H.A.克雷伯斯提出三羧循環學說以來，檸檬酸的發酵機理逐漸被人們所認識。已經證明，糖質原料生成檸檬酸的生化過程中，由糖變成丙酮酸的過程與酒精發酵相同，亦即通過E-M途徑（二磷酸己糖途徑）進行酵解。然后丙酮酸進一步氧化脫羧生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A和丙酮酸羧化所生成的草酰乙酸縮合成為檸檬酸并進入三羧循環途徑。 [8] 

檸檬酸是代謝過程中的中間產物。在發酵過程中，當微生物體內的烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低、而檸檬酸合成酶活性很高時，才有利于檸檬酸的大量積累。 [8] 

發酵工藝分表面發酵和固體發酵，按不同工藝制備不同原料的培養基，然后進行蒸料。蒸料的目的是將淀粉糊化，并進行滅菌。蒸料時要使物料受熱均勻，蒸汽通暢，邊蒸邊加料，把料加在冒汽的地方，逐層加入。蒸好的物料要揚散攤涼，當溫度降至37℃以下，即可補水接種，裝盤發酵，發酵終點以酸度來決定，定期測定酸度，保證在酸度最高時出料，以免檸檬酸被細菌分解。 [7] 

發酵結束后，要對發酵醛進行處理。表面發酵要即時把菌蓋和發酵液分開，再用少量水洗滌菌蓋和淺盤，發酵液和洗水合并；固體發酵中的檸檬酸要用水浸出，水溫80℃，浸出2~3次，浸水合并。發酵酸用壓濾機過濾，濾液和洗水合并，打入濾液槽。檸檬酸與鈣鹽和鈣堿反應生成檸檬酸鈣從液相中沉淀出來，與可溶性雜質分開。酸液中若含草酸多，則可在熱的中和液中，于pH值3以下沉淀析出，從而使草酸鹽先分離出來。中和終點用精密試紙測試，保持pH值在6.0~6.8。在85℃左右攪拌30分鐘，使硫酸鈣充分析出，過濾。檸檬酸鈣用硫酸酸解，按溶液中檸檬酸含量確定硫酸的用量，一般硫酸過量不超過0.2%。酸解后，酸液進行過濾。檸檬酸溶液的凈化通過吸附脫色和離子交換除去溶液中的色素、膠體和鐵離子、鈣離子、銅離子、鎂離子等金屬陽離子以及硫酸根離子等陰離子雜質。 [7] 

凈化多在色譜柱上進行，脫色炭是GH-15顆粒炭，離子樹脂是陰、陽樹脂。檸檬酸凈化液的濃度僅20%~25%，只有濃縮到70%以上才能進行結晶。濃縮時溫度不能過高，以免檸檬酸分解，凈化液的濃縮可在負壓下進行，為了節能，可采用雙效或三效蒸發器。濃縮分2段進行，第1次濃縮后，放入沉降槽中保溫沉降，再除去大部分石膏；第2次濃縮液含檸檬酸約80%，及時放料結晶。第2次濃縮可用升降式或括板式蒸發器，以減少料液和熱媒的接觸時間，可提高產品質量。結晶方式不同可得不同產品，一水檸檬酸的結晶是將80%溶液，溫度在55℃時，在結晶器中攪拌下自然冷卻，當溫度降至40℃時，加入晶種，開始結晶，控制溫度不超過36℃，此時產品為一水檸檬酸；如果溶液在60℃條件下濃縮到83%，冷卻至46℃加入晶種，維持溫度在40~60℃慢慢結晶，最終降到38℃，產品為無水檸檬酸。晶膏分密離心得結晶狀的商品檸檬酸。 [7]